Genové inženýrství, izolace nukleových kyselin a metody jejich analýzy

Genetické inženýrství je fenomén, který má své počátky již hluboko v minulém století. Dnes se pod pojmem genetické inženýrství představuje hlavně manipulace s nukleovými kyselinami a jejich případná modifikace. Manipulace s nukleovými kyselinami jsou dnes již na denním pořádku. Genetické inženýrství cíleně konstruuje buňky, respektive organismy, o takových kombinacích genů v genomech, které v přírodě neexistují. Zatímco pro klasickou dědičnost organismů je typický vertikální přenos DNA ("shora - dolů", myšleno z generace na generaci), metody genetického inženýrství umožňují i takzvaný horizontální přenos (přenos mezi jednou generací).

V současné době jsou všechny tyto postupy do značné míry zvládnuty a využívány ke studiu lidského, živočišného i rostlinného genomu, k diagnostice molekulárních chorob (dědičných chorob) a k jejich terapii a k výrobě nových látek včetně léků, a též ke šlechtění hospodářských rostlin.

Izolace nukleových kyselin

Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných například hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerázovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerázové reakci.

Pokud se DNA izoluje z buněk (například z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu.

Organická extrakce (fenol-chloroformová metoda)

Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Čtěte také: Podrobnosti o Ústavu inženýrství a ekonomiky staveb

Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi.

Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která DNA vysráží z roztoku. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt.

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Další metody extrakce DNA jsou založené například na extrakci varem, extrakci lýzou, extrakci chelatačním činidlem (Millerova metoda) nebo se používají komerčně dostupné izolační soupravy.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Enzymy v genetickém inženýrství

Základní metody genetického inženýrství byly vyvinuty díky převratným objevům v enzymologii nukleových kyselin. Těmito metodami lze změnit genovou výbavu organismu nebo upravit uspořádání genomu.

Restrikční endonukleázy (restriktázy)

Definované štěpení DNA bylo umožněno objevem restrikčních endonukleáz (restriktáz). Tyto enzymy štěpí dsDNA na zcela určité centrálně symetrické sekvence nukleotidů zvané palindrom. Restriktázy jsou přirozené enzymy bakterií, kde jsou součástí tzv. restrikčně-modifikačního systému. Tatáž sekvence je ve vlastní DNA tímto systémem methylována, což restriktázám brání v degradaci vlastní DNA. Systém je tedy mířen k degradaci cizorodé DNA, která dotyčné cílové sekvence nemá chráněny. Vnikne-li fágová DNA do baktérie, je v převážné míře degradována - fág podlehne restrikci. Jen výjimečně je některá z fágových DNA systémem methylována, fág přežije, byl modifikován a může se v daném bakteriálním kmenu množit.

Specifita restriktáz byla využita v enzymologii DNA. Bylo popsáno kolem stovky takových enzymů, nazývají se zkratkami názvů bakterie, v níž byly objeveny (EcoRI - E. coli, Haelll - Haemophilus influenzae). Každá restriktáza má specifickou cílovou sekvenci, v níž štěpí buď protější fosfodiesterové vazby dsDNA nebo vazby symetricky vzdálené několik nukleotidů od centra symetrie. Ve druhém případě se tvoří kohezní („lepivé“) konce vzniklých restrikčních fragmentů, které se mohou reasociovat, a to i s fragmenty získanými štěpením jiné DNA stejnou restriktázou. Tato možnost je velice výhodná při rekombinaci fragmentů a konstrukci nových genů a genomů.

Restrikční endonukleasy mají velký význam, neboť umožňují specificky vyštěpovat různé DNA sekvence. Existuje totiž relativně velké množství takovýchto endonukleas (izolovaných z různých bakterií), tudíž máme i velké množství možností na vyštěpování žádaných úseků DNA (existují tzv. restrikční mapy, kde jsou v genomových sekvencích naznačena místa, kde lze sekvenci určitou endonukleasou štěpit).

Příklady restrikčních endonukleáz a jejich cílových sekvencí

DNA-ligáza

Dalším biotechnologicky významným enzymem je DNA-ligáza, objevená při studiu přirozené replikace DNA. Při úpravách rekombinantní DNA se používají i další enzymy.

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Reverzní transkriptáza

Použitím reverzní transkriptasy (RNA-dependentní-DNA polymerasy) můžeme přepsat genetickou informaci z RNA do DNA. Běžně toto aplikují retroviry během svého životního cyklu, ale lze toho využít při syntéze cDNA. Písmenko c znamená "complementary" a vyjadřuje skutečnost, že vzniklá DNA je komplementární k RNA (nejčastěji mRNA).

Analytické metody v genetickém inženýrství

Na analýze nukleových kyselin je založena celá řada diagnostických metod.

Elektroforéza

Elektroforéza je dělící metoda, založená na rozdílné pohyblivosti dělených struktur v elektrickém poli. Úseky DNA, produkty PCR reakce nebo štěpy DNA můžeme v zásadě dělit chromatograficky nebo elektroforézou. Elektroforetické dělení je mnohem používanější. Dělení DNA (i RNA) fragmentů je založeno na skutečnosti, že zbytky fosforečné kyseliny (jakožto součásti nukleotidů) mají záporný náboj. Elektroforetické dělení NK probíhá nejčastěji na agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Menší částice (kratší úseky NK) se pohybují rychleji a urazí tedy delší vzdálenost. Stejně dlouhé fragmenty urazí tudíž stejně dlouhou vzdálenost.

Agarosová gelová elektroforéza

Provádí se zpravidla v gelu, a to buď agarosovém, nebo polyakrylamidovém. Agarosa je polysacharid tvořený D-galaktosou a anhydro-L-galaktosou, který produkují některé mořské řasy a pod názvem agar se používá k výrobě gelů v potravinářství, mikrobiologii, imunologii či biochemii. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarosy. Do agarosového gelu se většinou přímo přidává ethidiumbromid, takže po skončení elektroforézy lze jednotlivé frakce zobrazit UV zářením.

Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)

Jiným nosičem používaným při elektroforéze nukleových kyselin je polyakrylamidový gel. Polymerací akrylamidu vznikají lineární molekuly polyakrylamidu. Ty se spojují příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘-methylenbisakrylamidem. Akrylamid i methylenbisakrylamid jsou poměrně stabilní látky; polymerace probíhá v nepřítomnosti vzdušného kyslíku (odstraní se odvzdušněním pomocí vakua) a zahajuje se přimíšením katalyzátorů peroxydisíranu amonného (známého pod starším názvem persíran amonný, krátce APS) a N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminu (TEMED). Díky tomu, že polyakrylamid je méně reaktivní než agarosa, lze fragmenty DNA kromě metod používaných v agarosovém gelu obarvit i dalšími technikami.

Restrikční analýza (RFLP)

V diagnostice dědičných chorob se potom využívá takzvané restrikční analýzy, založené na polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). Jedná se o to, že různí lidé mají různou DNA sekvenci (zvláště v nekódujících oblastech DNA, kde se různé varianty nijak fenotypově neprojevují), tudíž mají i různě umístěná místa, kde mohou restrikční endonukleasy štěpit. Výsledkem je již zmíněný (a z diagnostického hlediska užitečný) polymorfizmus délky restrikčních fragmentů. Pokud můžeme tento fragment určit, potom označujeme analýzu jako informativní.

Na uvedeném hypotetickém příkladě si ukážeme základy restrikční analýzy. Matka (I/2) trpí hypotetickou autozomálně dominantní chorobou. V rodině je jedna další postižená osoba a to dcera (II/1). Byla provedena RFLP analýza (štěpení restrikční endonukleasou a následná elektroforéza fragmentů) a pod rodokmenem jsou prezentovány jejich výsledky. Pod každým jedincem jsou vidět dva fragmenty, jak byly rozděleny během elektroforézy. Otec má fragmenty o délce 10 kb (kilobází) a 15 kb. Dcera (II/1) má fragmenty o délce 15 kb a 10 kb. Jeden z nich musí pocházet od otce a druhý od matky. Zatímco fragment 15 kb může pocházet od obou rodičů; fragment 10 kb může pocházet pouze od otce (matka jej nemá). Obě postižené osoby mají fragment délky 15 kb od matky (označen červeně).

Hybridizace nukleových kyselin (Southern blotting)

Hybridizace je děj, při kterém se spojují dva komplementární řetězce, je možné kombinovat DNA i RNA. Často se využívá k identifikaci hledaného řetězce, nebo jeho části.

Southern blotting (přenos) je metoda, která umožňuje lépe vizualizovat výsledky elektroforézy nukleových kyselin. Pomocí alkalické kapaliny (pufru) necháme vzlínat molekuly DNA z gelu na fólii (nejčastěji z nitrocelulózy), kde se molekuly DNA fixují (teplem). Na fólii necháme působit další pufr s nukleotidovými sondami (v nadbytku), které hybridizují s komplementárními sekvencemi na fólii zachycených fragmentů DNA. Nyní již můžeme vizualizovat sondou značené fragmenty (podle použitého značení sondy buď autoradiografií nebo detekcí fluorescence).

Existují také Northern blotting (pro RNA) a Western blotting (pro proteiny).

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

PCR - Polymerase Chain Reaction (Polymerasová řetězová reakce) je metoda, díky které lze mnohonásobně naklonovat požadovaný úsek DNA, navíc v krátké době. Po snížení teploty mohou komplementární úseky opět renaturovat. Od nasednuvších primerů syntetizuje DNA-polymeráza zbytek sekvence (je důležité, aby šlo o termostabilní polymerasu, jinak by při zvýšené teplotě v první fázi cyklu došlo k její denaturaci a v této fázi by se po každém cyklu musela polymerasa opět přidat; využívají se polymerasy druhů bakterií, které žijí za vysokých teplot - např. Thermus aquaticus). Po čtvrté fázi následuje opět denaturace zvýšenou teplotou. Již po několika cyklech získáme veliké množství požadovaného úseku DNA. V počátcích genového inženýrství bylo velmi obtížné namnožit (naklonovat) požadovaný úsek molekuly DNA. Za tímto účelem byla požadovaná DNA sekvence integrována do plazmidu (mimojaderná cirkulární DNA molekula u bakterií) a ten byl vnesen do bakteriální buňky. Tento postup měl své nevýhody (především pomalou rychlost klonování a obtíže se zpětným izolováním namnoženého DNA fragmentu), proto je v současnosti již zcela nahrazován metodou PCR.

Mezi varianty PCR patří inverzní PCR, asymetrická PCR, multiplex PCR, mutageneze pomocí PCR, RT PCR (pro detekci a kvantifikaci produktů).

Syntéza DNA

Potřebný řetězec DNA lze připravit různým způsobem. Jsou již k dispozici dokonce automatizované postupy, jak syntetizovat DNA o žádané sekvenci z jednotlivých nukleotidů. Základním principem je potlačit na nukleotidech reaktivitu 3'-OH, 5'-OH a případně i -NH2 skupin, senzitivních na kondenzující agens. Jejich ochrany se docílí navázáním vhodných organických skupin, např. tritylové, benzoylové, acetylové apod. Tyto skupiny je možné snadno odstranit. Typickým příkladem je toto uspořádání: na kolonu se skleněným nosičem (drobné částice) je navázán první nukleotid, na němž jsou popsaným způsobem chráněny všechny skupiny kromě 5'-OH. Kolona je pak promývána roztokem dalšího, aktivovaného nukleotidu. Bývá to deoxyribonukleosid 3'-fosfoamidit, který se naváže na 5'-OH fixovaného nukleotidu. Po oxidaci trojmocného fosforu na pětimocný vzniká fosfodiesterová vazba a dinukleotid. Odstraní se protekce na jeho 5'-konci a kolona se promývá dalším aktivovaným nukleotidem atd. Popis postupu je značně zjednodušen, syntéza oligonukleotidu trvá hodiny. Rychlost procesu nesnese srovnání s rychlostí přirozené biosyntézy (např. v E. coli 16 000 bazí za minutu). Nicméně možnost vytvořit DNA o jakékoli primární struktuře je nesmírným pokrokem.

Klonování DNA a genové knihovny

Klonování DNA je proces, při kterém se vytváří identické kopie molekul DNA. Prvním krokem při klonování je inzerce požadovaného fragmentu do molekuly DNA, která je schopná replikace - např. plasmid nebo virový genom; vytvořená rekombinantní molekula DNA je pak vložena do rychle se dělící hostitelské buňky - např. bakteriální. Klonováním DNA můžeme získat vzácné buněčné proteiny ve velkém množství; pro tvorbu proteinů byly zkonstruovány tzv. genové „doplněné“ bakterie, resp. organismy.

Genomové knihovny

Knihovny většinou obsahují velké množství informací. Genové knihovny obsahují velké množství genetických informací (genů). Představte si, že celý lidský genom rozštěpíte endonukleázami na obrovský počet fragmentů. Každý fragment potom budete klonovat v jedné bakteriální populaci (v plazmidech).

cDNA knihovny

Pokud izolujeme všechny mRNA z určitého typu buňky (například z jaterní buňky - hepatocytu) a podle nich vytvoříme reverzní transkriptasou příslušné cDNA, které opět klonujeme v bakteriích, získáme cDNA knihovnu hepatocytu. Tímto způsobem zjišťujeme, jaké geny jsou v konkrétní buňce přepisovány.

Produkce proteinů a transgenní organismy

Bakterie lze rovněž využít pro produkci určitého proteinu. Jako první byl metodami rekombinantní DNA připraven lidský insulin. Nejprve musíme získat cDNA požadovaného proteinu (bakterie nemá schopnost odstraňovat z genu introny; vnesením celého lidského genu pro insulin bychom tak požadovaný produkt nezískali), kterou vložíme do bakteriálního plazmidu. Takto modifikované bakterie potom produkují vysoce kvalitní lidský insulin. Podobným způsobem lze však připravovat pouze jednoduché proteinové produkty, jejichž struktura je dána samotnou sekvencí aminokyselin.

Organismy, do kterých jsou vneseny nové nebo pozměněné geny, označujeme jako transgenní. Jako "knock-out" genu se označuje cílené vyřazení genu z funkce (například vytvořením STOP kodonu).

Sekvenování DNA

Poznání úplných a přesných sekvencí řady eukaryotních genů, včetně lidského genomu, umožnilo další pokrok v genetickém inženýrství. Mezi nejznámější metody sekvenování patří Maxam-Gilbertova metoda a Sangerova metoda a její modifikace. Projekt sekvenování lidského genomu (HGP) měl dalekosáhlé důsledky pro biomedicínu a genové inženýrství.

tags: #genove #inzenyrstvi #izolace #nk #podelne #steeni

Oblíbené příspěvky:

• Kompletní sortiment stavebních materiálů od STUPKA s.r.o. ve Vyškově-Dědicích
• Vše o prahových a bočních lištách pro Škoda Felicia
• Podrobnosti o T-kusech z PVC-U
• Srovnání materiálů pro terasy
• Proč zvolit dilatační profily Tondach?