Izolace DNA vazbou na silikátovou kolonku

Instruktážní video ukazuje metodu izolace DNA z plné krve adsorpcí na silikátovou membránu.

Základní kroky izolace nukleových kyselin

Metody izolace nukleových kyselin jsou v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků:

• Získání biologického materiálu.
• Rozpad tkání a buněk.
• Uvolnění nukleových kyselin z buněk.
• Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur.
• Purifikace nukleových kyselin.
• Rozpuštění nukleových kyselin ve vhodném objemu vody.

Princip kolonkové adsorpční metody

Kolonková adsorpční metoda využívá silné adsorpce molekul DNA v přítomnosti chaotropních solí, např. guanidinium thiokyanátu k silikátové membráně. Výhodou této metody je rychlá izolace DNA bez znečištění proteiny a dalšími látkami. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Význam kvality DNA pro PCR

Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.

Proces izolace DNA z buněk

Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Fenol-chloroformová metoda

Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Postup fenol-chloroformové metody

Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu.

Magnetická separace DNA

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Komerční kity pro izolaci DNA

Na trhu je dostupná široká škála kitů pro izolaci DNA z různých typů vzorků, často využívající optimalizované technologie.

EliGene® Kity

• EliGene® Viral RNA/DNA FAST Isolation Kit: Určen pro rychlou (15 min) izolaci virové RNA a DNA z bukálních stěrů, sputa a slin pomocí speciálně vyvinuté technologie pro odstranění inhibitorů.
• EliGene® Viral RNA / DNA FAST 96 Vacuum Isolation Kit: Navržen pro rychlou (méně než 40 minut) izolaci virové RNA a DNA z nasofaryngeálních výtěrů, bukálních stěrů, sputa a slin pomocí speciálně vyvinuté technologie pro odstranění inhibitorů.
• EliGene® Tissue DNA Isolation Kit: Umožňuje úsporu více než 1 hodiny práce a dosahuje vyšších výtěžků než u konkurenčních kitů díky inovované technologie bez použití proteinázy K.
• EliGene® FFPE Tissue DNA Isolation Kit: Určen pro izolaci genomové DNA z parafinových a formalínem fixovaných tkání. Optimalizovaný izolační protokol nevyžaduje použití xylenu pro odstranění vosku.
• EliGene® Blood DNA Isolation kit: Určen pro rychlou izolaci genomické a mitochondriální DNA z plné krve (čerstvá, zamražená nebo skladovaná při 4 °C).
• EliGene® Soil DNA Isolation Kit: Určen pro rychlou izolaci genomické DNA ze vzorků životního prostředí, primárně pro vzorky s vysokým obsahem huminových kyselin, včetně kompostu, černé půdy nebo hnoje.
• EliGene® Plant DNA Isolation Kit: Nejlepší volba pro rychlou a jednoduchou izolaci DNA z rostlinných buněk, určen pro různé typy vzorků, včetně listů Arabidospis, tabáku, rajčete, broskve nebo višně.
• EliGene® Gel DNA MiniPrep: Určen pro izolaci DNA fragmentů (80 bp až 10 kbp) ze standardního agarózového gelu nebo gelu s nízkou teplotou tání.
• EliGene® MTB Isolation Kit: Určen k izolaci DNA z M. tuberculosis (eventuelně dalších mikroorganizmů G+) z klinických materiálů jako je sputum, dekontaminované sputum, buněčné kultury, BAL, výpotek, moč, stěry.
• EliGene® Urine Isolation Kit: Určen pro izolaci genomické a mitochondriální DNA z plné krve (čerstvé, zamražené nebo skladované při 4°C), stěrů, kultivovaných buněk a moče.
• Doplněk pro izolaci ke kitu EliGene® Urine Isolation: Určeno pro izolaci ze vzorků spermatu, obsahuje reagencie pro přečištění vzorku a optimalizovaný lyzační pufr (Washing Buffer, Lysis Buffer).

Tabulka: Srovnání metod izolace DNA

Studie selektivní izolace DNA

V práci Ing. Jany Tvrdíkové (Ak. rok: 2008/2009) byly testovány magnetické nosiče funkcionalizované streptavidinem při selektivní izolaci DNA. Metoda selektivní izolace DNA byla testována s využitím DNA probiotického kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 211/06. Na nosiče s navázaným streptavidinem byl imobilizován biotinylovaný oligonukleotid a využit jako DNA sonda pro izolaci komplementárního řetězce DNA pomocí DNA/DNA hybridizace. Jako DNA sonda byl testován primer R 5´ bio a biotinylovaný denaturovaný PCR produkt specifický pro druh Lb. paracasei. Byly optimalizovány následující experimentální podmínky selektivní izolace DNA: teplota a doba hybridizace, množství DNA, eluce DNA z mikročástic. Izolace DNA byla ověřena pomocí PCR s rodově specifickými primery. Byl amplifikován rodově specifický PCR produkt o velikosti 250 bp, který byl prokázán pomocí gelové elektroforézy na agaróze.

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

tags: #izolace #dna #vazbou #na #silikatovou #kolonnku

Oblíbené příspěvky:

• oáza ve městě
• Průvodce obnovou barvy dlažby
• Kde koupit kuchyňské desky Frýdek-Místek
• Zemní vrut 80x60x100mm
• jak sladit vinylovou podlahu a bílé lišty