Izolace plazmidové DNA: Principy a využití

Izolace a purifikace DNA z živých buněk je základním krokem v mnoha molekulárně-genetických aplikacích, včetně klonování genů a analýzy DNA. Ačkoli někdy postačí velmi malé množství DNA, například pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), kvalita templátové DNA má zásadní vliv na účinnost následných reakcí. Nečistoty ve vzorku mohou působit jako inhibitory polymerázy nebo se vázat na templátovou DNA a znepřístupnit ji tak enzymatickým reakcím.

Plazmidy jako klonovací vektory

Plazmidy jsou důležitými vektory používanými při klonování genů. Jsou to mimochromozomální kruhové molekuly DNA, které se replikují nezávisle na bakteriálním chromozomu.

Charakteristika plazmidů

Plazmidy mají řadu charakteristických vlastností, které je činí ideálními pro klonování. Tyto vlastnosti zahrnují jejich schopnost autonomní replikace, přítomnost genů pro rezistenci k antibiotikům, které slouží jako selekční markery, a často i přítomnost multifunkčního klonovacího místa pro vložení cizí DNA.

Velikost a počet kopií

Velikost plazmidů se může lišit, stejně jako jejich počet kopií v buňce. Některé plazmidy jsou přítomny v nízkém počtu kopií, zatímco jiné, takzvané plazmidy s vysokým počtem kopií, se mohou vyskytovat v desítkách až stovkách kopií na buňku. To ovlivňuje výtěžek plazmidové DNA při izolaci.

Konjugace a kompatibilita

Plazmidy se mohou přenášet mezi bakteriemi procesem konjugace. Různé plazmidy mohou koexistovat v jedné buňce, pokud patří do odlišných kompatibilních skupin.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Klasifikace plazmidů

Plazmidy jsou klasifikovány na základě různých kritérií, včetně jejich genetických funkcí (např. F-plazmidy, R-plazmidy, virulentní plazmidy) nebo jejich replikačních vlastností.

Plazmidy v jiných organizmech, než jsou bakterie

Ačkoli jsou plazmidy nejznámější u bakterií, byly nalezeny i v jiných organismech, například v kvasinkách a některých rostlinných buňkách, kde také slouží jako klonovací vektory.

Purifikace DNA z živých buněk

Purifikace DNA z živých buněk je klíčový proces v molekulární biologii. Existují různé metody pro izolaci celkové buněčné DNA i specificky plazmidové DNA.

Izolace celkové buněčné DNA

Pokud se DNA izoluje z buněk, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu).

Růst bakteriální kultury a sedimentace bakteriálních buněk

Pro izolaci bakteriální DNA je nejprve nutné namnožit bakteriální kulturu a poté buňky sedimentovat centrifugací.

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Příprava bakteriálního extraktu

Po sedimentaci se buňky lyzují, aby se uvolnil jejich obsah, včetně DNA. Příprava bakteriálního extraktu je kritickým krokem pro získání DNA z buněk.

Izolace DNA z buněčného extraktu

Z buněčného extraktu se následně izoluje DNA, přičemž se odstraňují proteiny, RNA a další buněčné komponenty.

Zahuštění vzorku DNA

Zahuštění vzorku DNA je často nutné pro další analýzy, a provádí se například srážením DNA alkoholem.

Měření koncentrace DNA

Měření koncentrace DNA je důležité pro standardizaci následných experimentů a obvykle se provádí spektrofotometricky.

Izolace celkové buněčné DNA z jiných organizmů než bakterií

Izolace DNA z jiných organismů, jako jsou rostliny, živočichové nebo kvasinky, má podobné základní principy, ale může vyžadovat specifické úpravy v protokolu kvůli rozdílům v buněčné stěně nebo membránách.

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

Izolace plazmidové DNA

Izolace plazmidové DNA se zaměřuje na oddělení plazmidové DNA od chromozomální bakteriální DNA a dalších buněčných komponent.

Separace na základě velikosti

Separace plazmidové DNA od chromozomální DNA je možná na základě rozdílné velikosti. Plazmidy jsou obvykle mnohem menší než bakteriální chromozom.

Separace na základě konformace

Plazmidová DNA se často vyskytuje v superhelikální formě, která se liší od lineární chromozomální DNA. Tato rozdílná konformace se využívá při separačních technikách, jako je alkalická lýza, kde se superhelikální plazmidy renaturují rychleji než denaturovaná chromozomální DNA.

Amplifikace plazmidu

Pro zvýšení výtěžku plazmidové DNA je možné použít amplifikaci plazmidu, například inhibicí syntézy chromozomální DNA pomocí chloramfenikolu, zatímco replikace plazmidu pokračuje.

Metody purifikace DNA

Existuje několik metod purifikace DNA, které se liší v účinnosti, rychlosti a vhodnosti pro automatizaci.

Fenol-chloroformová extrakce

Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K, která částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která snižuje dielektrickou konstantu a způsobuje vysrážení DNA. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA). Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze

Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Srovnání metod purifikace DNA

Využití klonování genů a analýzy DNA

Klonování genů a polymerázová řetězová reakce (PCR) jsou zásadní pro studium polohy a struktury genů, zkoumání jejich exprese a funkce a celkové studium genomů.

Izolace genu klonováním

Klonování genů umožňuje izolovat specifický gen z celého genomu a amplifikovat jej ve velkém množství. Izolace genu klonováním je základním nástrojem pro další genetické manipulace a studie.

Izolace genu pomocí PCR

Pomocí PCR lze izolovat a amplifikovat specifické sekvence DNA i z velmi malého množství templátu. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním.

tags: #izolace #plasmidové #DNA #principy #a #využití

Oblíbené příspěvky:

• srovnání plastifikátorů
• Odolné zatravňovací tvárnice IG 40
• Ochrana dřeva: Impregnace stavebního řeziva
• Nadčasový design: Psací stůl a beton
• Zvyšte efektivitu práce s pilami díky vodicím lištám Bosch