Izolace a využití restrikčních enzymů v molekulární biologii

Molekulu DNA si můžeme představit jako obrovskou knihovnu, ve které jsou uloženy knihy s návody a předpisy, podle nichž je sestaveno naše tělo. Pokud bychom však do některé z těch knih nahlédli, moc bychom si nepočetli. Obsahovala by totiž nepřebernou směs čtyř na první pohled náhodně seřazených písmen A, C, G, T (adenin, guanin, cytosin, thymin). Každému z nich přísluší jedna báze v DNA. Jednotlivá slova jsou pak nazývána biology geny.

I kdybychom uměli ta slova přečíst, obsahu stěží porozumíme. Mezi jednotlivými slovy (geny) leží ohromné množství písmen, která nekódují žádnou bílkovinu. Tyto periodicky se opakující sekvence tvoří pozůstatek po našich vývojových předcích a prohrabat se množstvím balastu až k samotnému genu představovalo pro vědce velký oříšek.

Restrikční endonukleázy jako molekulární nůžky

Řešení problému přesného dělení dlouhých molekul DNA přišlo spolu s objevením třídy enzymů nazývaných restrikční endonukleázy. V podstatě nepředstavují nic jiného než další z důmyslných nástrojů, které si buňky v průběhu evoluce vytvořily ke své obraně. Dají se přirovnat k nůžkám s přesnými zářezy, které zapadnou do určitého místa v řetězci DNA (se specifickým pořadím písmen) a zde molekulu rozstřihnou. Jako kadeřník sevře nůžky a vlasy padají k zemi, tak stříhací enzym sám vybere přečnívající vlas a udělá „šmik“. Molekulární biologové vzali tyto „kadeřníky DNA“ do služby právě k úpravě různých úseků ve šroubovici.

Původ restrikčních enzymů

Původ těchto stříhajících enzymů najdeme při pozorování obranných mechanizmů bakterií. Jako všichni živí tvorové i bakterie mají svůj genetický potenciál uložený v molekule DNA. V okolním prostředí se nachází obrovské množství volné DNA (např. z odumřelých organizmů). Tyto molekuly nebo jejich útržky mohou proniknout do bakteriální buňky, začlenit se do její DNA a způsobit tím velkou „paseku“. V naší analogii s knihou by šlo o vpisování mezi řádky, případně o tvrdou cenzuru, což by samozřejmě smysl textu zcela zastřelo.

Restrikce v souvislosti s biologií je obranný mechanismus bakterií proti infekci bakteriofágy. Bakterie mají tzv. restrikční enzymy neboli restrikční endonukleázy, které štěpí dvouřetězcovou DNA v určitých místech na fragmenty, které jsou pak dále rozkládány jinými endonukleázami. Bakterie tímto způsobem účinně likvidují cizí DNA, která je do buňky vnesena infekčním agens (tedy bakteriofágem). Svou vlastní DNA přitom bakterie chrání před degradací prostřednictvím metylace, tj. navázáním metylových skupin (-CH3).

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Enzymy, které jsou součástí restrikčně-modifikačních systémů, katalyzují endonukleolytické štěpení sekvencí DNA, které nemají druhově specifický metylační vzorec DNA hostitelské buňky. Štěpením vznikají náhodné nebo specifické dvouřetězcové fragmenty s koncovými 5'-fosfáty. Úkolem restrikčních enzymů je zničit jakoukoli cizí DNA, která pronikne do hostitelské buňky. Většina z nich byla studována v bakteriálních systémech, ale několik jich bylo nalezeno i v eukaryotických organismech.

Typy restrikčních enzymů a jejich názvy

Stejně jako můžete navštívit salón krásy nebo kadeřnictví na rohu ulice, existují rovněž různé druhy molekulárních nůžek pro DNA. Jejich názvy používané v molekulární genetice nezapírají svého původního nositele. Například nejznámější spolustolovník hodující v našich střevech, bakterie Escherichia coli, poskytl vědcům enzym s názvem EcoRI.

Využití restrikčních enzymů v genovém inženýrství

Po uvedení restrikčních enzymů do praxe nastal doslova boom v genovém inženýrství. Malincí kadeřníci jsou při výběru vystřižených míst velmi precizní, aby následně po nich mohli práci přebrat další trpasličí dělníci. Ti však již nebourají, ale lepí různá vlákna zpět k sobě. Přitom vůbec nezáleží na tom, zda levý konec DNA pochází od myši a pravý darovala třeba pivní kvasinka. Tak lze vytvářet unikátní, běžně se nevyskytující molekuly DNA a ty posléze vkládat do námi zvolených organizmů. Na tomto principu je založena i tvorba geneticky modifikovaných organizmů (GMO). Restrikční endonukleázy jsou dnes nepostradatelnou součástí při studiu molekulární biologie a jsou běžným předmětem obchodu specializovaných firem.

Používají se také jako nástroje pro systematickou disekci a mapování chromozomů, při určování sekvencí bází DNA a umožnily sestřih a rekombinaci genů z jednoho organismu do genomu jiného.

Další kroky po štěpení DNA

Rozštěpením dvoušroubovicové molekuly DNA získáme řadu nestejně dlouhých vláken, která však pro další studium (např. izolaci genu) musíme nejprve od sebe vzájemně oddělit. K jejich roztřídění slouží postupy elektroforézy.

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Izolace enzymů produkujících depolymerizační aktivitu

Byla provedena izolace a identifikace mikroorganismů produkujících depolymerizační enzymy vybraných polymerů. Zdrojem zmíněných mikroorganismů byly vzorky kompostů, které byly naočkovány na kultivační půdy obsahující polyestery polybutylen adipát/tereftalát (PBAT) nebo kyselinu polymléčnou (PLA) v podobě submikročástic.

Metodika izolace a identifikace

Celkem bylo zkoumáno 5 vzorků kompostu, které byly dále charakterizovány dostupnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi jako je pH, sušina a spalitelný podíl. Ze vzorků kompostů byla prováděna izolace bakterií schopných tvořit zóny hydrolyzovaného polymeru kolem svých kolonií, což bylo považováno za důkaz produkce extracelulárních depolymerizačních enzymů.

Výsledky izolace

• V případě kultivační půdy s obsahem PLA nebyly zóny pozorovány, tudíž nebyla izolována žádná bakteriální kultura hydrolyzující PLA.
• Naopak v případě kultivační půdy s obsahem PBAT byly izolovány čtyři bakteriální kmeny.

Identifikace izolovaných kmenů

Izolované kmeny z půdy s obsahem PBAT byly později identifikovány jako blízce příbuzné kmenům Actinomadura rubrobrunea DSM 43750, Thermobispora bispora DSM 43833 a Thermomonospora curvata DSM 43183. Pro identifikaci izolovaných bakterií byla použita metoda sekvenace genu 16S rRNA, byla izolována DNA mikroorganismu a po purifikaci vzorku byl tento odeslán k sekvenaci.

Tato tabulka shrnuje výsledky izolace bakteriálních kmenů z kompostů na různých kultivačních půdách:

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

tags: #izolace #restrikcnich #enzymu

Oblíbené příspěvky:

• optické zvětšení koupelny pomocí šedých obkladů
• Využití plastových palubek
• návod na omítání sádrokartonových stěn
• Náprava vlhké izolace
• Stěrky na okna: Kärcher a SPOKAR HOME