Optimalizace izolace RNA z tukové tkáně: Srovnání kitů pro extrakci RNA

Cílem této práce bylo optimalizovat izolaci RNA z tukové tkáně a ověřit její parametry. Tuková tkáň je pro izolaci RNA náročný materiál vzhledem k vysokému obsahu lipidů, které mohou interferovat s procesem extrakce a purifikace.

Materiál a metody

Pro studii byla použita tuková tkáň (cca 100 mg) odebraná pacientům během chirurgických výkonů. Vzorky tkáně byly uchovány ve stabilizačním činidle RNAlater (QIAGEN GmbH, Německo) pro zachování integrity RNA.

Kity pro izolaci celkové RNA

Pro izolaci celkové RNA byly použity následující kity:

  • RNeasy Protect Mini Kit (QIAGEN GmbH, Německo)
  • RNeasy Lipid Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Německo)
  • MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) pro přístroj MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics GmbH, Německo)

Principy extrakce RNA

Izolace nukleových kyselin probíhá prostřednictvím vazby nukleových kyselin na magnetické partikule a na jejich následném vyvázání do elučního pufru. Reagencie jsou připravené v jednorázových reagenčních náplních, což eliminuje nutnost reagencie uchovávat v zásobnících a kontrolovat jejich množství a stav. Součástí kitů je sada jednorázového spotřebního plastového materiálu, který je k procesu extrakce zapotřebí. Jedná se o reakční komoru, ve které probíhá celý proces izolace nukleových kyselin; dále o propichovací hroty, sloužící k otevření fólie na reagenčních náplních, a o jednorázové špičky s filtrem určené k pipetování a přenášení reagencií. Propichovací hroty a špičky jsou v přístroji uloženy v plastovém držáku, jenž je také součástí kitu.

Fenol-chloroformová metoda

Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která sníží dielektrickou konstantu roztoku, a tím i rozpustnost DNA. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze

Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Výsledky

Izolace RNA byla hodnocena na základě výtěžku a čistoty RNA, stejně jako její schopnosti amplifikace v následných RT-PCR reakcích.

Výtěžky RNA

Výtěžky RNA při použití jednotlivých kitů jsou shrnuty v následující tabulce:

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Kit Výtěžek RNA (μg/ml) N (počet vzorků)
RNeasy Protect Mini Kit 37,5 ± 20,7 63
RNeasy Lipid Tissue Kit 85,9 ± 36,3 29
MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) 50,6 ± 13,6 28

Čistota RNA

Poměry R260 nm/280 nm, indikující čistotu RNA, se pohybovaly v rozmezí 1,6-2,0 pro všechny testované kity. Celková RNA nebyla kontaminována DNA s výjimkou vzorků z RNeasy Protect Mini Kit.

Validace postupu a amplifikace

Validace postupů, hodnocená prostřednictvím RT-PCR pro beta-2-mikroglobulin, potvrdila podobnou míru schopnosti amplifikace vzorků RNA. Přesnost postupu byla do 7 %.

Závěr

RNeasy Lipid Tissue Kit a MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit (Tissue) splňují požadavky kladené na izolaci RNA z tukové tkáně, poskytují vzorky RNA vysoké kvantity, čistoty a amplifikovatelnosti. Tyto kity jsou vhodné pro molekulárně-genetické vyšetření, které začíná polymerázovou řetězovou reakcí.

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

tags: #izolace #rna #metoda #chomczynskeho

Oblíbené příspěvky: