Charakterizace ekvivalentní molekulové hmotnosti polystyrenu a polyolefinů v gelové permeační chromatografii

Charakterizace rozložení molekulových hmotností polymerů je klíčová pro pochopení jejich fyzikálních vlastností a výkonu v aplikacích. Gelová permeační chromatografie (GPC/SEC) využívá rozdílů v hydrodynamickém objemu k separaci makromolekul a vyžaduje kalibraci pomocí standardů. Výběr vhodných kalibrantů a správné nastavení metody je zásadní pro přesné určení ekvivalentní molekulové hmotnosti polyolefinů.

Princip gelové permeační chromatografie (GPC/SEC)

Gelová permeační chromatografie (GPC), někdy také označovaná jako size exclusion chromatography (SEC), je separační metoda založená na principu rozdílné velikosti a tvaru molekuly, při které separace téměř nezávisí na fyzikálně-chemických vlastnostech dělených látek.

Stacionární fáze je tvořena inertním nerozpustným polymerním gelem, který vytváří síť s definovanou velikostí pórů gelu. Stacionární fáze je umístěna v koloně, kterou kontinuálně prochází mobilní fáze. Separační proces je primárně závislý na charakteru stacionární fáze (velikosti, tvaru, množství a relativním objemu pórů gelu), dále závisí na velikosti a rozložení částic stacionární fáze. Separační proces je také závislý na charakteru mobilní fáze a její průtokové rychlosti.

Po nástřiku dělené látky do GPC systému, je vzorek unášen mobilní fází směrem k separační koloně. Dělené látky s malou relativní molekulovou hmotností mohou difundovat do pórů gelu, čímž dojde k jejich zpožďování vůči mobilní fázi. Oproti tomu látky s velkou relativní molekulovou hmotností nemohou difundovat do pórů gelu a jsou unášeny průtokem mobilní fáze směrem k detektoru nebo sběrači frakcí. Z toho vyplývá, že ze separační kolony budou nejdříve eluovat látky s velkou relativní molekulovou hmotností a jako poslední opustí kolonu látky s nejmenší relativní molekulovou hmotností. Chceme-li rozdělit nějakou směs co nejlépe, musíme vybrat stacionární fázi s co nejvhodnějším rozsahem velikosti otvůrků. Takový výběr proto záleží na předpokládaném rozsahu velikosti (molekulové hmotnosti) složek dělené směsi.

Podle polarity stacionární a mobilní fáze rozlišujeme systémy hydrofilní a hydrofobní. V naprosté většině se však setkáváme s těmi prvními, tedy se systémy hydrofilními, a mezi nimi zcela převažuje systém polysacharidových skeletů stacionární fáze a vodných roztoků jako mobilní fáze.

Čtěte také: Použití a hmotnost MDF desek

Aplikace GPC v polymerní chemii a biochemii

GPC našla své uplatnění především při stanovení relativních molekulových hmotností a distribuce molekulových hmotností syntetických polymerů a biopolymerů. Purifikace proteinů je odvětví, ve kterém GPC našlo využití. Dalším odvětvím, ve kterém GPC našlo použití, je potravinářský průmysl, kde se využívá například při analýzách želatiny a škrobů.

Kalibrace GPC/SEC systémů a význam polystyrenových standardů

Tento technický přehled porovnává konvenční kalibrační křivky vytvořené za použití polystyrenových a polyethylénových úzkých standardů v trichlorbenzenu (TCB) při 160 °C. Cílem je vyhodnotit lineární rozsah kalibrace, identifikovat odchylky a ukázat přínos univerzální kalibrace pro analýzu polyolefinů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza proběhla na systému Agilent PL-GPC 220 s následujícími podmínkami:

  • Kolony: 3 × Agilent PLgel 10 µm MIXED-B, rozměry 7,5 × 300 mm (p/n PL1110-6100)
  • Eluent: trichlorbenzen (TCB) + 0,0125 % butylhydroxytoluenu (BHT)
  • Průtok: 1,0 mL/min
  • Objem injekce: 200 µL
  • Teplota: 160 °C
  • Detektory: refraktometrický detektor (RI) a viskometr Agilent PL-BV400HT

Pro univerzální kalibraci byly využity Mark-Houwinkovy parametry:

Polymer K (dL/g) a
Polystyren v TCB 12,1 × 10⁻⁵ 0,707
Polyethylen v TCB 40,6 × 10⁻⁵ 0,725

Hlavní výsledky a diskuse

Konvenční kalibrace ukázala, že polystyrenové standardy s Mp až do 7 × 10⁶ Da vykazují lineární závislost retenční doby na logaritmu molekulové hmotnosti. Naproti tomu polyethylénové standardy do 1,2 × 10⁵ Da vykazují významný pokles sklonu křivky při nižších molekulových hmotnostech, což indikuje odchylky od čistého vyloučení velikosti.

Čtěte také: Použití OSB desek

Univerzální kalibrace (log[η × M] vs. retenční doba) prokázala, že polystyren a vysoko-molekulární polyethylenové standardy leží na společné lineární křivce, zatímco nízkomolekulární polyethylen vykazuje odchylky. Tento jev poukazuje na dodatečné interakce uvnitř kolon a omezenou platnost konvenční kalibrace u nízkých hmotností PE.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledky potvrzují, že polystyrenové kalibranty v TCB poskytují konzistentní a lineární kalibraci napříč širokým rozsahem hmotností, což je výhodné při stanovení ekvivalentní molekulové hmotnosti polyolefinů. Univerzální kalibrace s online viskometrem nabízí možnost generalizovat výsledky pro různé polymery i bez přímého přístupu k viskometru, použitím vhodných Mark-Houwinkových konstant.

Budoucí trendy a možnosti využití očekávají širší využití univerzální kalibrace doplněné o online detekci viskozity a nové polymerní standardy s lepším pokrytím nízkých molekulových hmotností. Také se rozvíjí vývoj kolon s optimalizovanou inertností pro omezení nepříznivých interakcí a zajištění čisté separace dle velikosti.

Porovnání polystyrenových a polyethylénových kalibrantů v TCB ukazuje, že polystyren poskytuje konzistentní lineární kalibraci napříč celým rozsahem molekulových hmotností.

Detektory pro gelovou permeační chromatografii

Refraktometrický detektor (RI)

Detektor indexu lomu neboli refraktometrický detektor je nejběžněji používaný detektor ve spojení s GPC/SEC systémy. Detektor indexu lomu je založen na měření změn indexu lomu mobilní fáze, která protéká měřící celou. Měření změn indexu lomu je diferenční, tj. měří se změna indexu lomu oproti referenční cele. Pomocí refraktometrického detektoru lze detekovat všechny látky, jejichž index lomu se dostatečně liší od indexu lomu mobilní fáze. Nevýhodou refraktometrického detektoru je závislost indexu lomu na teplotě a tlaku, a proto je teplota v refraktometrickém detektoru přísně regulována.

Čtěte také: Plošná hmotnost a akustika podlah

Při použití detektoru indexu lomu jako jediného detektoru v systému GPC/SEC lze určit relativní koncentrace různých datových řezů v píku vzorku, což v kombinaci s kalibrační křivkou umožňuje výpočet momentů relativní molekulové hmotnosti (Mn, Mw, Mz). Pokud je refraktometrický detektor kombinován s detektorem rozptylu světla a viskozimetrickými detektorem, je možné určit přesnou koncentraci vzorku v každém datovém řezu a s její znalostí vypočítat absolutní molekulovou hmotnost a vnitřní viskozitu. Získáme tak přesnou koncentraci vzorku v každém datovém řezu pomocí hodnoty dn/dc vzorku.

Firma MALVERN Panalytical používá v GPC systému OMNISEC REVEAL vysoce citlivý modul detektoru indexu lomu pro přesné měření koncentrace vzorku, popř. hodnoty dn/dc. Detektor slouží k určení koncentrace vzorku. Jeho robustní průtoková cela je udržována v sérii s jinými detektory pro dosažení maximální citlivosti. Tento modulární diferenciální detektor indexu lomu je uložen v prostředí, ve kterém lze regulovat teploty až na 55 °C pro zlepšení základní stability signálu. Regulaci teploty lze také vypnout a pracovat za teploty okolního prostředím, například v chladné místnosti nebo chladícím boxu. Průtočná 9 μl měřicí cela minimalizuje rozšiřování pásma (band-broadening).

UV/Vis detektory

UV detektory pracují buď při pevné vlnové délce nebo lze vlnovou délku měnit v závislosti na analytu. Absorpce UV záření se řídí Lambert-Beerovým zákonem, podle kterého je množství absorbovaného záření funkcí počáteční intenzity záření, délky optické dráhy paprsku v kyvetě, koncentrace analytu a jeho molárního absorpčního koeficientu. Použití UV detektoru je omezeno absorpcí eluentu při pracovní vlnové délce. UV/Vis detektory můžeme rozdělit na ty s fixní vlnovou délkou, nejčastěji 254 nm a na detektory s nastavitelnou vlnovou délkou a nebo na UV/Vis DAD, tedy na detektory s diodovým polem, které zaznamenávají celé spektrum vlnových délek. Používají se jako detektor koncentrace vzorků z chromoforů a pro měření dA/dc.

Firma MALVERN používá v systému OMNISEC REVEAL DAD detektor s UV-fotodiodovým polem za účelem dosažení citlivého a přesného měření absorbance UV a viditelného světla. Současně měří všechny vlnové délky v rozsahu 190 až 900 nm pomocí 1024 diodového pole. Plně spektrální 2D a 3D displeje lze použít k identifikaci materiálů s různými spektry a vlnovými délkami maximální absorbance vzorku.

Viskozitní detektor

Viskozitní detektor je tvořen čtyřmi kapilárami sestavenými do „Wheatstoneova“ můstku. Pokud detektorem protéká pouze čisté rozpouštědlo, jsou všechny kapiláry naplněny tímto rozpouštědlem. Když do viskozitního detektoru začne proudit eluát z GPC/SEC systému, začne tento eluát plnit kapiláry číslo 1, 2 a 4, zatímco kapilára číslo 3 obsahuje čisté rozpouštědlo. Díky zvýšení viskozity v kapilárách 1, 2 a 4 oproti kapiláře č. 3 dojde k tlakové nerovnováze ve „Wheatstoneově“ můstku, která je měřena tlakovým snímačem. Vstupní tlak (inlet pressure Pin) a diferenciální tlak jsou přímo úměrné specifické viskozitě polymerního roztoku.

Vzhledem k tomu, že měřené koncentrace polymerních roztoků jsou velmi nízké, je možno přímo stanovit limitní viskozitní číslo. Spojení refraktometrického a viskozitního detektoru poskytuje přesné stanovení molární hmotnosti pro všechny typy polymerů, na které lze aplikovat univerzální kalibraci. S viskozitním měřením lze získat vedle stanovení vnitřní viskozity a hydrodynamického poloměru i cenné informace o stupni větvení, které nejsou při měření se samotným refraktometrickým detektorem dostupné.

Systém OMNISEC REVEAL od společnosti MALVERN je vhodným nástrojem citlivé a přesné měření vnitřní viskozity syntetických a přírodních polymerů a proteinů. Ten v rámci výše popsané konstrukce Wheatstoneova můstku obsahuje patentovaný jednorázový kapilární samovyvažovací můstek, který lze snadno vyměnit a dále automatický vyvažovací mechanismus pro dosažení maximální stability, citlivosti a robustnosti měření. Převodníky jsou vyrobeny z nerezové oceli 316 pro maximální kompatibilitu mobilní fáze s širokým rozsahem pH a koncentraci solí. Dále konstrukce obsahuje vysoce robustní diferenciální tlakový převodník pro omezení rizika poškození během provozu.

Detektory pracující na principu rozptylu světla

Dalším typem detektoru, kterým lze stanovit molární hmotnost vzorku, je detektor rozptylový. Během měření prochází laserový paprsek do kyvety s eluátem, který opouští chromatografickou kolonu. Dopadající primární laserový paprsek se rozptyluje o rozpuštěné molekuly analytu. Intenzita rozptýleného světla je úměrná velikosti částic, rozdílu indexů lomu a koncentraci částic. Molární hmotnost měřená rozptylovým detektorem se stanoví pomocí Rayleighovy rovnice, kterou lze zjednodušeně uvést ve tvaru:

R(θ) = K * C * M * P(θ)

kde R(θ) je intenzita rozptýleného světla na úhlu θ, C je koncentrace částic v roztoku, M je hmotnostní průměr molární hmotnosti a K je optická konstanta. Pro výpočet molární hmotnosti je nutno stanovit R (θ) při nulovém rozptylovém úhlu. Toho lze dosáhnout použitím tzv. detektoru „Nízko úhlového rozptylu světla“ (Low Angle Light Scattering, LALS), což je detektor, který snímá rozptýlené světlo pod úhlem menším než 10° vzhledem k primárnímu paprsku.

Firma MALVERN ve svém systému OMNISEC REVEAL používá unikátní detektor rozptylu světla RALS/LALS. Tento detektor obsahuje pravoúhlý (RALS) a nízko úhlový detektor (LALS). RALS maximalizuje citlivost pro měření materiálů s nízkou molekulovou hmotností, zatímco LALS maximalizuje přesnost měření molekulové hmotnosti pro vzorky s vysokou molekulovou hmotností Mw. Detektor RALS snímá rozptýlené světlo pod úhlem 90°. Může měřit molekulovou hmotnost s vysokou citlivostí pro vzorky, které rozptylují světlo izotropně, tj. stejně ve všech směrech; nelze však měřit molekulovou hmotnost pro anizotropní rozptylovače (ovlivňované úhlovou závislostí). Detektor LALS sbírá rozptýlené světlo pod úhlem 7°. Může měřit molekulární hmotnost pro všechny molekuly, ale má nižší poměr signálu k šumu. Kombinací RALS a LALS detektorů lze měřit molekulovou hmotnost všech vzorků při maximalizaci odstupu signálu od šumu. Tato kombinace tak slouží pro citlivé a přesné měření absolutní molekulové hmotnosti syntetických a přírodních polymerů i proteinů.

Víceúhlové detektory (MALS)

Další možností stanovení molární hmotnosti je měření rozptýleného světla pod různými úhly a následná extrapolace k „nulovému“ úhlu. V tomto druhém případě hovoříme o tzv. „Více úhlovém detektoru rozptylu světla“ (Multi Angle Light Scattering, MALS). Pomocí těchto rozptylových detektorů lze stanovit jak hmotnostní průměr molární hmotnosti, tak velikost částic (gyrační poloměr). MALS může měřit molekulovou hmotnost jak pro izotropní, tak anizotropní rozptylovače. Pro anizotropně rozptylující částice může také měřit poloměr otáčení (radius of gyration).

Firma MALVERN Panalytical používá detektory Viscotek SEC-MALS 20 a SEC-MALS 9. Detektor SEC-MALS - 20 citlivě detekuje světlo pomocí rozptylového systému s 20 detektory uspořádanými od 12 do 164 stupňů s regulací teploty do 60 °C. Design vertikální průtokové cely zlepšuje přesnost a opakovatelnost měření a zajišťuje, že potřeba čištění cely je významně snížena. Dvacetiúhlový detektor měří od méně než 1000 do více než 10^7 Daltonů s vynikající citlivostí a přesností. Vyžaduje přítomnost detektoru indexu lomu (RI) nebo UV detektoru a analogový výstup.

Detektor SEC - MALS 9 používá stejnou vertikální průtočnou kyvetu s radiálním optickým designem jako SEC - MALS 20 a také dosahuje vysoké citlivosti a nízkého odstupu signálu od šumu. Pracuje s rozptylovými úhly 28°, 44°, 60°, 76°, 90°, 108°, 124°, 140°, 156°, objem průtočné cely je 63 mikrolitrů.

Kombinované detektory

Při detekci a charakterizaci chemicky heterogenních systémů, jako jsou vzorky biologického původu, směsi nízkomolekulárních látek a polymerů nebo kopolymery, je často nevyhnutelné současné využití více detekčních principů. V takových případech je nejjednodušší spojení dvou a nebo více detektorů do série. Příkladem mohou být tzv. duální detektory, které současně měří absorpci světla při dvou vlnových délkách, nebo UV absorpci a změny indexu lomu. V moderních přístrojích se často setkáváme s kombinovanou detekcí umožňující stanovení absolutní hodnoty molárních hmotností polymerů a strukturální charakteristiky. Příkladem mohou být duální detektory spojující refraktometr (detekce koncentrace) a viskozimetr (detekce viskozity), refraktometr a detektor rozptylu světla.

Základní terminologie ve fyzikální chemii polymerů

Česká komise pro makromolekulární nomenklaturu předkládá českou verzi dokumentu vydaného v roce 1988 Mezinárodní unií pro čistou a užitou chemii (IUPAC) jako doporučení pro základní terminologii ve fyzikální chemii polymerů. Poměr průměrné hmotnosti molekuly odpovídající vzorci látky k jedné dvanáctině hmotnosti atomu nuklidu 12C se nazývá molární hmotnost, která se obvykle vyjadřuje v jednotkách g/mol nebo kg/mol.

Mezi další důležité pojmy patří:

  • Interakce mezi segmenty: Interakce mezi segmenty, které v řetězci leží daleko od sebe a které se v důsledku ohebnosti molekuly občas k sobě přibližují.
  • Gyrační poloměr: Parametr charakterizující velikost částice jakéhokoli tvaru. Druhá odmocnina střední kvadratické vzdálenosti konců řetězce lineárního polymeru průměrované přes všechny konformace řetězce.
  • Obrysová délka: U jednopramenné molekuly polymeru se obrysovou délkou obvykle míní vzdálenost konců řetězce protaženého do konformace, při níž jsou všechny vazby v poloze trans. Někdy se termínem „obrysová délka“ označuje součet délek všech vazeb hlavního řetězce jednopramenné molekuly polymeru.
  • Uniformní polymer: Kopolymer obsahující lineární molekuly s jednotnou relativní molekulovou hmotností a s jednotným elementárním složením.
  • Neuniformní polymer: Kopolymer obsahující lineární molekuly s jednotnou relativní molekulovou hmotností a s jednotným elementárním složením, avšak s rozdílným pořadím různých typů monomerních jednotek.
  • Průměry molární hmotnosti: V zásadě je možné definovat nekonečný počet průměrů molární hmotnosti, avšak jen několik typů průměrů lze přímo experimentálně stanovit. Nejdůležitější průměry se definují jednoduchými momenty distribučních funkcí a získávají se metodami použitelnými pro systémy v termodynamické rovnováze, jako jsou osmometrie, rozptyl světla a sedimentační rovnováha. Každý průměr molární hmotnosti může být definován pomocí hmotnostních zlomků nebo molárních zlomků.
  • Distribuční funkce: Distribuční funkce mohou být diskrétní (nespojité), tj. definované pouze pro určité specifikované hodnoty náhodné proměnné, nebo spojité, tj. definované pro libovolnou hodnotu náhodné proměnné ležící v daných mezích. Distribuční funkce mohou být integrální (neboli kumulativní), vyjadřující podíl populace, pro který je náhodná proměnná menší nebo rovna dané hodnotě.
  • Theta stav: Stav roztoku polymeru, ve kterém je druhý viriální koeficient roven nule. V některých ohledech se roztok ve stavu theta podobá ideálnímu roztoku a tento stav můžeme označit za pseudoideální stav.
  • Theta teplota: Teplota, při které je roztok ve stavu theta.
  • Viriální koeficienty: Parametry vyjadřující odchylky od ideálního chování roztoku polymeru.
  • Vyloučený objem: Objem, z kterého makromolekula ve zředěném roztoku efektivně vylučuje všechny ostatní makromolekuly. Záleží na Gibbsově a Helmholtzově energii míšení rozpouštědla a polymeru.
  • Expanzní faktor: Poměr rozměrové charakteristiky makromolekuly v daném rozpouštědle při dané teplotě k téže rozměrové charakteristice ve stavu theta při téže teplotě.
  • Floryho-Hugginssova teorie: Termodynamická teorie roztoků polymerů poprvé formulovaná nezávisle Florym a Hugginsem.
  • Rozpustnostní parametr: Parametr charakterizující interakci polymer - rozpouštědlo.
  • Frikční tenzor: Tenzor, který koreluje frikční sílu F, působící proti pohybu částice ve viskózní tekutině, a relativní rychlost u této částice vůči tekutině.
  • Hydrodynamicky ekvivalentní koule: Velikost hydrodynamicky ekvivalentní koule se může lišit pro různé druhy pohybu makromolekuly.
  • Perlový model: Model simulující hydrodynamické vlastnosti řetězovité makromolekuly složený z řady kuliček, z nichž každá klade toku okolního prostředí hydrodynamický odpor a je s nejbližší kuličkou spojena tuhou tyčinkou, která hydrodynamický odpor neklade.
  • Perlově-pružinový model: Model simulující hydrodynamické vlastnosti řetězovité makromolekuly složený z řady kuliček, z nichž každá klade toku okolního prostředí hydrodynamický odpor a je s nejbližší kuličkou spojena pružinou, která nepřispívá k frikční interakci, ale je nositelem elastických a deformačních vlastností řetězce.
  • Přívlastek volně drénovaný: Přívlastek označující řetězovitou makromolekulu, jejíž segmenty vyvolávají při pohybu prostředím tak malé frikční účinky, že hydrodynamické pole v okolí daného segmentu není přítomností ostatních segmentů ovlivněno.
  • Koeficient sedimentace: Parametr charakterizující pohyb částice v odstředivém poli a definovaný jako rychlost u pohybu způsobeného jednotkovým odstředivým zrychlením.
  • Relativní viskozita: Poměr rozdílu viskozity roztoku a viskozity rozpouštědla k viskozitě rozpouštědla.
  • Redukovaná viskozita: Poměr inkrementu relativní viskozity k hmotnostní koncentraci c polymeru.
  • Limitní viskozitní číslo (intrinzní viskozita): Limitní hodnota redukované viskozity nebo inherentní viskozity při nekonečném zředění polymeru. Tato veličina a veličiny definované v 3.2.20 a 3.2.21 nejsou ani viskozity ani prostá čísla. Na tyto termíny je nutno pohlížet jako na tradiční názvy.
  • Mark-Houwinkova rovnice: Empirická rovnice vztahující limitní viskozitní číslo k molární hmotnosti polymeru. Příspěvek Kuhna a Sakurady byl též významný a jejich jména bývají někdy zahrnuta do názvu rovnice.
  • Rozptyl světla: Paprsek záření procházející prostředím může být zeslaben a částečně rozptýlen. Dále uvedené definice se vztahují k těm případům, kdy je zeslabení dopadajícího paprsku způsobeno pouze rozptylem, energie rozptylovaných kvant je stejná jako energie kvant primárního paprsku (elastický rozptyl) a fázové vztahy mezi nezávislými rozptylovými centry jsou zachovány (koherentní rozptyl). Tento dokument se zabývá rozptylem světla (LS), maloúhlovým rozptylem záření X (SAXS) a maloúhlovým rozptylem neutronů (SANS). Při rozptylu světla je významná jeho polarizace; zde uvažujeme pouze rovinně polarizované světlo, které nazýváme vertikálně polarizované (v), je-li elektrický vektor paprsku kolmý k rovině, v níž leží zdroj, vzorek a detektor, a horizontálně polarizované (h), leží-li elektrický vektor v této rovině.
  • Rayleighova částice: Částice mnohem menší než vlnová délka záření v prostředí.
  • Mieova částice: Částice s rozměry srovnatelnými s vlnovou délkou záření v prostředí nebo většími.
  • Změna indexu lomu: Změna indexu lomu roztoku, n, s koncentrací rozpuštěné látky, C. Koncentrace rozpuštěné látky se nejčastěji udává jako hmotnostní koncentrace, molalita nebo objemový zlomek.
  • Rayleighův poměr: (viz 3.3.3) k intenzitě záření rozptýlené v nulovém úhlu.
  • Rozptylová funkce částic: Rozptylová funkce částic, která (obvykle) obsahuje z-průměr gyračního poloměru.
  • Zimmův graf: (viz 3.3.3) proti q, a užívané pro určení tvaru molekul.
  • Rozměrově vylučovací chromatografie: Název „gelová permeační chromatografie“ by se měl užívat pouze, pokud porézním neadsorbujícím materiálem je gel. Délka lože pro rozměrově vylučovací chromatografii odpovídající jednomu patru.

tags: #co #je #ekvivalentni #molekulova #hmotnost #polystyren

Oblíbené příspěvky: