Izolace DNA z periferní krve: Metody a principy

Izolace DNA z plné krve je zásadní krok v mnoha molekulárně-genetických vyšetřeních. Instruktážní video ukazuje metodu izolaci DNA z plné krve adsorpcí na silikátovou membránu, ale existuje celá řada dalších technik. Metody izolace nukleových kyselin jsou v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků:

• Získání biologického materiálu.
• Rozpad tkání a buněk.
• Uvolnění nukleových kyselin z buněk.
• Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur.
• Purifikace nukleových kyselin.
• Rozpuštění nukleových kyselin ve vhodném objemu vody.

Kvalita DNA a vliv nečistot

Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.

Organická extrakce DNA (Fenol-chloroformová metoda)

Fenol-chloroformová technika je stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Kroky fenol-chloroformové metody

1. Homogenizace a lýza buněk: Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
2. Extrakce a purifikace: Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží. Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
3. Oddělení fází: Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi.
4. Vysrážení DNA: Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z roztoku např. jejím vysolením nebo pomocí jednoduchých alkoholů (etanolu nebo izopropanolu). Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), v níž je DNA nerozpustná.
5. Promývání a rozpouštění: Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Metody izolace DNA na bázi pevné fáze

Další metody extrakce DNA jsou založené např. na kolonkové adsorpci nebo magnetické separaci.

Kolonková adsorpční metoda (silikátová membrána)

Kolonková adsorbční metoda využívá silné adsorpce molekul DNA v přítomnosti chaotropních solí, např. guanidinium thiokyanátu k silikátové membráně. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Výhodou této metody je rychlá izolace DNA bez znečištění proteiny a dalšími látkami. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Srovnání metod izolace DNA

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

tags: #izolace #dna #zperiferni #krve

Oblíbené příspěvky:

• jak správně vybrat závětrnou lištu
• kde koupit štěrk v Chebu
• Přečtěte si, jak Chameleon tmel efektivně vyrovnává povrchy
• Montáž PIR izolace na střešní konstrukci
• jak upravit vnitřní a vnější omítky