Izolace kmenových buněk zubní pulpy a jejich potenciál v regenerativní medicíně

Zubní dřeň, neboli zubní pulpa, představuje relativně snadno dostupný zdroj postnatálních mezenchymových kmenových buněk (MKB). Tyto buňky se vyvíjejí z mezenchymu v rané fázi embryonálního života a mají velmi úzký vztah k dentinu, proto se dnes hovoří o komplexu zubní dřeň - dentin, známém jako dentinopulpální orgán. Oddělená zubní dřeň si uchovává stavbu typickou pro primitivní (embryonální) tkáně, a kmenové buňky izolované ze zubní dřeně (KBZD) by proto měly vykazovat některé vlastnosti podobné embryonálním kmenovým buňkám. Kromě toho, že jsou MKB schopné spontánně generovat celé spektrum buněk mezenchymového původu, jsou také schopny konverze i v elementy odlišných zárodečných listů. Takový terapeutický potenciál lze očekávat pouze od lidských embryonálních kmenových buněk, které však nesplňují předpoklad histokompatibility s tkáněmi příjemce. KBZD jako postnatální kmenové buňky mají tu výhodu, že dárce nebo jeho zákonný zástupce může dát informovaný souhlas s jejich využitím.

Struktura a funkce zubní dřeně

Zubní dřeň je měkká nemineralizovaná tkáň uložená v dřeňové dutině zubu, tvořená řídkým vazivem s četnými krevními a lymfatickými cévami a nervovými vlákny. Má čtyři základní funkce:

• Formativní funkce: Projevuje se tvorbou primárního i sekundárního dentinu.
• Nutritivní funkce: Zajišťuje dentinu zásobování živinami z cévního řečiště pomocí odontoblastů a jejich výběžků.
• Senzorická funkce: Obstarávají ji nervová vlákna, která zprostředkovávají vnímání bolesti. Kromě senzických vláken (aferentních) jsou v zubní dřeni přítomna i vlákna eferentní (vazomotorická), ovládající oběh v krevním řečišti.
• Obranná schopnost: Uplatňuje se při mechanickém, termickém, chemickém či bakteriálním dráždění a projevuje se tvorbou terciárního dentinu.

Zubní dřeň se skládá z buněk a mezibuněčné hmoty. Na periferii zubní dřeně jsou umístěny odontoblasty, které tvoří jednu řadu buněk. Jsou to postmitotické buňky, a pokud jsou zničeny, musí je nahradit buňky, které se diferencují z prekurzorů odontoblastů (nediferencované vazivové buňky, fibroblasty). Nejčastěji jsou v zubní dřeni zastoupeny fibroblasty, které produkují kolagenní vlákna a amorfní substanci. Bezprostředně pod odontoblasty je vrstva s velmi malým počtem buněk, tzv. bezbuněčná vrstva Weilova, oddělená od centrálněji uložené zubní dřeně vrstvou bohatou na buňky, tzv. buněčnou zónou. Dále jsou přítomny makrofágy, dendritické buňky, T a B lymfocyty, žírné buňky a nediferencované vazivové buňky. Matrix zubní dřeně se skládá z kolagenních vláken (typu I a III) a amorfní základní hmoty (glykosaminoglykany, glykoproteiny a voda).

Zubní dřeň je bohatě zásobena krevními cévami a nervovými vlákny, které vstupují apikálním otvorem. Arterie probíhají uprostřed zubu a větví se na kapiláry, vytvářející bohatou subodontoblastickou pleteň. Nervová vlákna vytvářejí pod vrstvou odontoblastů bohatě členěnou síť - Raschkowovův subodontoblastický plexus. Skládají se převážně ze senzitivních aferentních vláken n. trigeminus a ze sympatických eferentních vláken.

Patologické stavy zubní dřeně

Z histopatologického hlediska lze rozlišovat regresivní a degenerativní změny pulpy, zánět pulpy (pulpitida), nekrózu pulpy a gangrénu. Tyto stavy se v rámci dřeně jednoho zubu vzájemně prolínají a jsou stanovitelné pouze na histologickém preparátu zubu, což postrádá význam pro praxi.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

• Regresivní změny: Zahrnují dystrofii a atrofii, kdy dřeň již není plnohodnotná. Příčinou může být stárnutí zubů nebo choroby parodontu.
• Pulpitida: Je zánětlivé postižení zubní dřeně, které vzniká nejčastěji na podkladě bakteriální infekce pronikající porušenou zubovinou z kazivého ložiska. Důsledkem zánětlivého edému je zvýšení tlaku a bolest.
• Nekróza pulpy: Stav, kdy zub ztratil svou vitalitu.
• Gangréna: Vzniká infikováním nekrotické pulpy bakteriemi, což vede k výrazně zapáchající gangrenózní pulpě.

Klinická klasifikace stavů pulpy dle Baumeho se řídí klinickými projevy a pro správné určení je nutné odebrat důkladnou anamnézu.

1. Zdravá dřeň: Přiměřená reakce na termické podněty (nepříjemný pocit okamžitě odezní), negativní poklepová citlivost, pozitivní reakce na elektrické dráždění.
2. Reverzibilně poškozená dřeň: Bez spontánní bolestivosti, může být pozitivní poklepová citlivost (u kazu, papilitidy, po úrazu či bělení), krátkodobě zvýšená citlivost na chlad.
3. Ireverzibilně poškozená dřeň: Spontánní bolestivost, dlouhodobě přetrvávající citlivost na chlad a teplo, obtížně lokalizovatelná bolest. V pokročilejších stádiích kruté, vystřelující bolesti neuralgiformního charakteru, které nepotlačí ani silná analgetika.
4. Infikovaná nekróza (gangréna): Zub nereaguje vitálně.

Izolace kmenových buněk zubní pulpy (KBZD)

KBZD byly poprvé izolovány v roce 2000 a jejich schopnost sebeobnovy, diferenciace ve zralé buněčné typy in vitro a vysoký proliferační potenciál byly poprvé popsány v roce 2002. Od té doby se jeví jako velmi slibný zdroj buněk pro regenerativní medicínu. Extrakce zubu se provádí jako plánovaný výkon a zub spolu se zubní dření je považován za biologický odpad. Využití těchto tkání pro izolaci KBZD tak pro pacienta nepředstavuje operační výkon navíc.

Nejčastěji jsou za těmito účely využívány třetí moláry (77,6 % případů), které jsou často extrahovány z důvodu retence či semiretence. Druhou nejčastější skupinou (10,7 % případů) jsou první premoláry, které jsou v indikovaných případech extrahovány z ortodontických důvodů okolo 12. roku věku. Jedná se tak často o intaktní zuby s nedokončeným vývojem kořene. Třetí nejčastěji využívané zuby jako zdroj KBZD jsou nadpočetné zuby.

V současné době existují dvě metody izolace KBZD:

1. Metoda enzymatického štěpení (enzymatic digestion, ED): Při enzymatické izolaci se suspenze KBZD získává štěpením tkáně působením enzymů, nejčastěji směsí kolagenázy typu I a dispázy v poměru koncentrací 1:1. Doba působení enzymů je okolo 30-60 minut. Výsledkem štěpení je suspenze jednotlivých buněk různého původu, zbytky cév a extracelulární matrix. KBZD poté adherují ke dnu kultivační nádoby a při výměně média se ostatní nečistoty odstraní.
2. Metoda spontánního vycestování z tkáně (explants method, EM): Ačkoliv je technicky méně náročná, všeobecně více využívaná metoda k izolaci mezenchymálních kmenových buněk je enzymatická izolace. KBZD získané enzymatickou metodou vykazují vyšší proliferační aktivitu, diferenciační potenciál a vyšší schopnost mineralizace.

Prvním krokem, který je společný pro obě metody, je oddělení zubní dřeně od tvrdých zubních tkání extrahovaného zubu.

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Optimalizace izolačního protokolu

Cílem studií je optimalizovat proces izolace KBZD, zejména zkrátit dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. V jedné ze studií byly extrahovány stálé zuby od dárců ve věku 14 až 18 let (jeden mesiodens, dva semiretinované třetí moláry a dva první premoláry s nedokončeným vývojem kořene).

Materiály a metodika

• Extrakce zubu probíhala v lokálním znecitlivění za aseptických podmínek.
• Zub byl dekontaminován 0,2% vodným roztokem chlorhexidin glukonátu a uložen v transportním médiu.
• Izolace zubní dřeně probíhala v laminárním boxu za přísně sterilních podmínek.
• Dřeň byla rozstříhána na malé fragmenty (do 1 mm3) a rozmělněna v tkáňovém minihomogenizátoru.
• Pro enzymatické štěpení byla směs inkubována s 0,05% trypsinem ve vodní lázni při 37 °C po dobu 10 minut.
• Působení enzymu bylo inhibováno inaktivačním médiem.
• Primokultura KBZD byla kultivována v modifikovaném kultivačním médiu (α-MEM) obohaceném o 2 % fetálního bovinního séra, růstové faktory, antibiotika, antimykotika a Insulin-Transferrin-Sodium-Selenium supplement.
• Proliferační aktivita, velikost a viabilita buněk byly měřeny pomocí přístrojů Z2-Counter a Vi-Cell analyzer.
• Fenotypová analýza byla provedena pomocí průtokového cytometru Cell Lab Quanta.
• Pro diferenciaci v chondroblasty, osteoblasty a adipocyty byla použita komerčně dostupná diferenciační média.

Výsledky a závěry

V rámci studií se podařilo KBZD kultivovat až do 8. pasáže. Buňky dosáhly průměrně 47,8 ± 2,0 populačních zdvojení (PD) a průměrný čas potřebný pro zdvojení populace (DT) činil 39,2 ± 6,1 hodin. Po celou dobu kultivace byly buňky proliferačně aktivní. Průměrná viabilita v 2. pasáži byla 92,3 ± 1,5 % a v 8. pasáži 92,4 ± 1,4 %.

Fenotypovou analýzou byla prokázána vysoká exprese povrchových antigenů pro mezenchymové kmenové buňky (CD13, CD29, CD44, CD90, CD73, CD166) a naopak nízká či nízce pozitivní exprese znaků CD31, CD34, CD45, typických pro endoteliální a hematopoetickou buněčnou řadu. KBZD se diferencovaly ve zralé buněčné typy, osteoblasty a chondroblasty.

Optimalizovaný izolační protokol pro KBZD zkrátil dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. KBZD izolované touto metodou prokazovaly po celou dobu kultivace vysoký proliferační a diferenciační potenciál, bez známek spontánní diferenciace či degenerace.

Tabulka: Fenotypová analýza KBZD (expresní profil povrchových antigenů)

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

tags: #izolace #kmenových #buněk #zubní #pulpy #informace

Oblíbené příspěvky:

• Kompletní průvodce zátkami pro PVC trubky DN 50
• Vše o nosných konstrukcích pro kabelové žlaby
• Konstrukce dřevěné střechy
• Detailní návod na lepení minerální vlny na Powerpanel
• Vše o anhydritových podlahách v Teplicích