Izolace a analýza nukleových kyselin

Izolace a purifikace nukleových kyselin jsou základními kroky pro mnoho molekulárně-biologických a genetických vyšetření. Správná izolace zajišťuje vysokou čistotu a výtěžek DNA nebo RNA, což je klíčové pro úspěšnost následných analýz, jako je PCR, sekvenování nebo hybridizace.

Struktura nukleových kyselin

Mononukleotid obsahuje tři složky, a sice pentózu, fosfát a dusíkatou bázi. Centrální postavení mezi nimi má pentóza, buď β-D-ribofuranóza (ribóza) nebo 2’-deoxy-β-D-ribofuranóza (deoxyribóza). V nukleotidech se uhlíky pentózy číslují s apostrofem (C2’..cé dvě s čarou), aby se odlišily od uhlíků báze. Podle typu pentózy se rozlišují ribonukleové kyseliny (ribonucleic acid, RNA) a deoxyribonukleové kyseliny (DNA).

Konformace pentózy

Pentóza se vyskytuje v různých konformacích. Jestliže C2’ vystupuje nad rovinu furanózového kruhu shodně s C5’, jde o konformaci 2’-endo, jestliže takto vystupuje C3’, konformace se nazývá 3’-endo.

Dusíkaté báze a nukleosidy

Na C1 pentózy je N-β-glykosidovou vazbou navázána báze. V RNA se thymin vyskytuje jen výjimečně, DNA neobsahuje uracil. Sloučenina dusíkaté báze se sacharidem se nazývá nukleosid, podle pentózy ribonukleosid (konkrétně adenosin, guanosin, cytidin, thymidin) nebo deoxyribonukleosid (deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin, deoxyuridin).

Heterocykly bazí jsou ploché, jejich rovina je přibližně kolmá k rovině furanózového kruhu pentózy. Na první pohled se zdá, že báze může vzhledem k pentóze rotovat kolem glykosidové vazby. Sterické zábrany však umožňují zaujmout pouze syn- nebo anti- konformaci, podle toho, zda je báze kolem glykosidové vazby otočena nad plochu pentózy (syn-) nebo na stranu opačnou (anti-). Esterifikací sacharidu kyselinou trihydrogenfosforečnou z nukleosidu vzniká nukleotid.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Značení nukleových kyselin

Komise IUPAC rezervovala jednopísmenové symboly C, T, A, G apod. pro nukleosidy zařazené v oligo- nebo polynukleotidu. Píše se CpUpGpAp nebo C-U-G-Ap v případě RNA a d(pApGpT) nebo d(pA-G-T) v případě DNA. Fosfáty (a koncové fosfáty) se značí malým písmenem p. Pokud není polarita řetězce udána čísly nebo šipkami mezi písmeny, pak 5’-konec řetězce se v zápisu nalézá vlevo a 3’-konec vpravo. Je-li na některém konci symbol p, znamená to, že koncová 5’- nebo 3’-OH skupina je esterifikována fosfátem. Předpona deoxy- se zpravidla u thymidinu vynechává, takže dT je thymidin. T je ribosylthymin, vyskytuje se např. v tRNA. Zkratky ATP, CDP, dGMP jsou rezervovány pouze pro nukleosid-5’-fosfáty, nikoli 3’- nebo 2’-fosfáty. Fosfát se může fosfodiesterovou vazbou vázat na dva uhlíky téže pentózy, čímž vzniká ve sloučenině další heterocyklus, proto se sloučenina nazývá cyklický nukleotid.

Minoritaní báze a tautomerie

Vedle uvedených základních složek se v nukleových kyselinách vyskytují další, tzv. minoritní báze a nukleosidy. Většinou vznikají dodatečnou metylací báze nebo pentózy po jejich vestavění do polynukleotidu, existuje např. N-6-metyladenosin (m6A), 5-metylcytosin (m5C), 2’-O-metylguanosin (Gm). V transferových RNA se nachází dihydrouracil a thyminribosid. Minoritní báze a nukleosidy se asi účastní tvorby signálních míst nebo jejich substituenty chrání nukleovou kyselinu před štěpením nukleázami. Další báze jsou metabolity základních bází, např. hypoxantin (6-oxopurin), xantin (2,6-dioxopurin) a kyselina močová (2,6,8-trioxopurin).

Z vlastností bazí je významná jejich tautomerie, kdy se izomery liší rozložením elektronů a protonů v molekule. Tato skutečnost je umožněna aromatickým charakterem heterocyklických kruhů, které existují v tautomerní rovnováze. U aminoskupin pozorujeme amino/imino tautomerii, u oxoskupin máme keto/enol tautomery. V buňce při pH kolem 7 převažuje laktamová forma u uracilu, guaninu a thyminu a laktimová forma u cytosinu a adeninu. Tautomerie je důležitá pro správné párování bazí ve dvouřetězcových nukleových kyselinách. Další vlastností bazí je jejich charakteristické spektrum s maximem λ=260 nm.

Hydrolýza nukleových kyselin

Pro stanovení primární sekvence nukleových kyselin je potřebnější enzymová hydrolýza, kterou katalyzují nukleázy.

Chemická hydrolýza

• K alkalické hydrolýze polynukleotidu je třeba 2’-OH skupina, neboť prvním jejím krokem je přesun vazby z C5’ následujícího nukleotidu na C2’ téhož nukleotidu. Tím se přeruší osa polynukleotidu a přechodně se vytvoří cyklický 2’,3’-fosfát, jenž se dále degraduje na směs 2’ a 3’-fosfátů.
• Mírnou kyselou hydrolýzou (pH asi 3) se selektivně štěpí β-glykosidová vazba purinových nukleotidů. Výsledkem je apurinový polynukleotid.
• V silně kyselém prostředí a při vyšší teplotě (HCl o konc. 6mol.l−1, 175 °C) se RNA i DNA štěpí na jednotlivé složky.

Enzymová hydrolýza - nukleázy

Nukleázy rozeznávají 3’- a 5’-exonukleázy, podle toho, od kterého konce polynukleotidu postupně odštěpují mononukleotidy. Endonukleázy jsou specifické vzhledem k pentóze, existují ribonukleázy (RNázy) a deoxyribonukleázy (DNázy).

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

Dalším kritériem specificity nukleáz je polovina fosfodiesterové vazby, kterou štěpí. Nukleázy štěpící vazbu blíže C3’ uvolňují nukleosid-3’-fosfáty.

Příklady nukleáz a jejich specifita

• Fosfodiesteráza z hadího jedu je 3’-exonukleáza štěpící α-vazby v RNA i DNA.
• Fosfodiesteráza z hovězí sleziny je 5’-exonukleáza štěpící β-vazby polynukleotidu.
• Pankreatická RNáza je endonukleáza, která štěpí v RNA β-vazby, pokud na α-vazbu daného fosfátu se napojuje pyrimidinový nukleotid.

Metody izolace DNA

Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci.

Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.

Fenol-chloroformová extrakce

Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Postup fenol-chloroformové metody:

1. Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány.
2. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
3. Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
4. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi, např. lipidy. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami.
5. Následuje proto vysrážení DNA z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování).
6. Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která sníží polaritu celého roztoku, a DNA se vysráží.
7. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu.
8. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze

Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.

Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Amplifikace a detekce nukleových kyselin

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Polymerázová řetězová reakce (PCR) umožňuje selektivní namnožení specifických fragmentů DNA z genomové DNA nebo cDNA. Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním.

Restrikční endonukleázy

Díky objevení enzymů - restrikčních endonukleas - bylo umožněno získat různě dlouhé fragmenty, které mohou být dále analyzovány. Restrikční endonukleasy jsou enzymy izolované z bakterií, které štěpí dvouvláknovou DNA ve specifických sekvencích. Enzymy chrání bakterie před vniknutím cizorodé DNA. Endonukleasy štěpí DNA tak, aby vznikaly přečnívající úseky tzv. kohezní nebo lepivé konce a fragmenty DNA, které mají definovanou délku. Restrikční endonukleasy mohou štěpit rekombinantní molekuly DNA za účasti enzymu DNA-ligasy a komplementarity mezi lepivými konci, např. enzym EcoRI izolovaný z E. coli.

Samotné množení je založeno na tvorbě rekombinantních molekul DNA, které vznikají spojením různých úseků molekul DNA pocházejících z taxonomicky odlišných druhů. Další důležitá DNA molekula nezbytná pro množení DNA, je tzv. vektor, do kterého je fragment DNA vložen. Rekombinovaný vektor je poté vnesen do hostitelského organismu.

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace NK je spojování podle pravidel párování bazí. Spočívá v denaturaci dvoušrobovice DNA a následné renaturaci. Může nastat mezi dvěma vlákny DNA, DNA a RNA, nebo RNA a RNA.

Molekula DNA nebo RNA, která může být na základě hybridizace využita k detekci komplementární sekvence nukleové kyseliny, se nazývá sonda. Sondy musí být použity v jednovláknové podobě a označené tak, aby bylo možné hybridizační reakci zviditelnit. Jako sondy mohou být využity - klonované sekvence DNA, sekvence získané PCR, syntetické oligonukleotidy, RNA získání transkripcí klonované DNA in vitro.

DNA mikročipy

DNA mikročip je obvykle skleněná destička, na které jsou připojeny tisíce různých sekvencí DNA v určitém pořadí.

Sekvenování DNA

Byly vyvinuty dvě metody pro sekvenování DNA - Sangerova (dideoxy chain termination method) a Maxam-Gilbertova metoda (chemické degradace).

Sangerova metoda

Základem je použití směsi standardních deoxynukleotidtrifosfátů (dNTPs) a modifikovaných dideoxynukleotidtrifosfátů (ddNTPs) při přípravě úseku DNA, který bude sekvenován. Modifikovaný ddNTPs má za následek ukončení syntézy DNA. Celý proces probíhá ve 4 separátních enzymových reakcích.

Postup Sangerovy metody:

1. Každá reakce obsahuje - templátovou DNA v jednovláknové podobě, DNA-polymerasu, primer, 4 dNTPs a modifikovaný nukleotid dideoxynukleotidtrifosfát (ddNTPs).
2. V každé ze 4 reakcí je jiný ddNTP - ddATP, ddGTP, ddCTP, nebo ddTTP.
3. Po skončení sekvenace jsou molekuly DNA separovány kapilární elektroforézou - produkty procházejí kapilárou, kde se dělí dle velikosti.

Maxam-Gilbertova metoda

Základem je izolace a purifikace DNA, následné štěpení restrikčním enzymem za vzniku tisíců různě velkých fragmentů. Dalším krokem je elektroforetické rozdělení podle velikosti fragmentů. Poté je gel ponořen do alkalického roztoku, díky kterému se DNA denaturuje. Následuje blotting, což je přenesení denaturovaných fragmentů na membránu, která je vystavena teplotě 80 °C a fragmenty se na ní fixují.

tags: #izolace #nukleovych #kyselin #wikiskripta

Oblíbené příspěvky:

• Truhlářská dílna
• tvorba polystyrenových 3D log
• Diagnostika konstrukcí
• Průvodce výběrem fotbalových branek
• Jak vyložit prostor na dřevo: podrobný návod