Metody izolace plazmidové DNA

Izolace plasmidové DNA je v mikrobiologii důležitou a často využívanou metodou. Předchází jí příprava bakteriálních kompetentních buněk a amplifikace plasmidů. Plazmidy, jako jsou CHR2, ASAP1, ASAP-3, ASAP-5 a Kir2.1, jsou nejprve amplifikovány v bakteriích E. coli kmenu DH5 a poté izolovány.

Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerázovou reakci výrazně zpomalovat. Nečistoty reakci zpomalují tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerázové reakci. Pokud se DNA izoluje z buněk, je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů. Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.

Organická extrakce DNA - Fenol-chloroformová metoda

Fenol-chloroformová technika je stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin, ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA.

Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a neinhibují ho ani koncentrované tenzidy; částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.

Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi. Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Následuje proto vysrážení DNA z vodného roztoku.

Čtěte také: Metody izolace plazmidové DNA

Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol), která vysráží DNA z roztoku. Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).

Výhody a nevýhody fenol-chloroformové metody

• Výhody: Vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA.
• Nevýhody: Metoda je časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.

Extrakce pomocí silikátové pevné fáze

Tato metoda využívá křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá a hodí se i pro automatizaci.

Magnetická separace

Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).

Srovnání metod izolace DNA

K určení správnosti izolace plasmidové DNA slouží gelová elektroforéza a transfekce do buněčné linie HEK293. Při molekulárně-genetickém vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Nicméně, optimalizace metod izolace plazmidové DNA je klíčová, zejména u bakterií degradujících chlorované uhlovodíky. V této souvislosti se ukazuje, že standardní postupy komerčně dostupných izolačních kitů jsou často nedostatečné, jelikož extrahují veškerý genetický materiál. Řešení nabízí aplikace enzymu exonukleázy, jenž odstraní lineární chromozomální DNA, zatímco kružnicovou plazmidovou DNA zachová.

Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost

Čtěte také: Kročejová izolace a její použití

tags: #izolace #plasmidove #dna #metody

Oblíbené příspěvky:

• objemová hmotnost polystyrenu
• Profesionální tipy pro sloupky plotu
• betonové schody svépomocí
• Řešení zpevnění střechy
• Sanace a omítání kamenného a smíšeného zdiva