PergolyIzolace a purifikace DNA: Metody a principy
Při molekulárně-genetickém vyšetření, které často začíná polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), je někdy potřeba jen velmi malé množství DNA. V některých případech lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk, které se lyzují například hydroxidem, tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Nicméně kvalita templátové DNA významně ovlivňuje účinnost amplifikace během PCR. Nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerázovou reakci výrazně zpomalovat tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerázové reakci.
Pokud se DNA izoluje z buněk (například z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem nebo leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk. Buněčné a jaderné membrány se obvykle rozpouštějí účinkem tenzidů.
Extrakce a purifikace DNA
Vzniklý lyzát obsahuje kromě DNA řadu kontaminujících látek - všechny nízkomolekulární i vysokomolekulární součásti tkáně nebo buněk. Následuje proto extrakce a purifikace DNA z lyzátu. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Organická extrakce DNA
Nejčastěji používaným denaturačním a precipitačním činidlem bývá fenol. Vysrážené bílkoviny se poté oddělí vytřepáním do chloroformu a centrifugací. Přitom se současně odstraní i hydrofobní součásti směsi, např. lipidy. Fenol-chloroformová technika je proto stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Mezi výhody organické extrakce patří vysoký výtěžek a vysoká čistota purifikované DNA.
Fenol-chloroformová metoda
Fenol-chloroformová metoda je nejpoužívanější technikou organické extrakce DNA. Ačkoli je náročnější na čas a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi, umožňuje dosáhnout vysokých výtěžků a získat prakticky čistou DNA. Metoda je ale časově náročná a pracuje se při ní s nebezpečnými chemikáliemi. Při zpracování velkého počtu vzorků se obtížně automatizuje. Je také třeba zajistit, aby v závěru extrakce byly spolehlivě odstraněny zbytky fenolu a chloroformu, které by interferovaly s navazujícími metodami.
Čtěte také: Vlastnosti dřevovláknité izolace – požární odolnost
Postup fenol-chloroformové metody:
- Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí buněčné membrány.
- Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tenzidy, částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny.
- Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny.
- Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování).
- Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol). Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu.
- Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA). EDTA chelatuje kovové ionty, které by mohly podporovat degradaci DNA.
Extrakce DNA pomocí silikátové pevné fáze
Po odstranění kontaminujících bílkovin a lipidů je DNA stále znečištěná převážně nízkomolekulárními látkami. Využívá se křemičitých kuliček s velkým povrchem, kterými je například naplněná krátká chromatografická kolonka. Ve vodných roztocích je povrch silikátu hydratovaný. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je pak možné odmýt. Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci.
Magnetická separace DNA
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem nebo povrchem s jinými vhodnými funkčními skupinami. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků. Výtěžky a čistota DNA jsou srovnatelné se silikátovou extrakcí, je však možné izolovanou DNA získat v menším množství roztoku (tj. koncentrovanější).
Látky a jejich role při izolaci DNA
| Látka | Role při izolaci DNA |
|---|---|
| Hydroxid, tenzidy, zmrazování/rozmrazování | Lýza buněk a tkání |
| Proteázy (např. proteináza K) | Hydrolyzují kontaminující bílkoviny |
| Fenol | Denaturuje a sráží bílkoviny |
| Chloroform | Pomáhá oddělit sražené bílkoviny a hydrofobní složky |
| Izoamylalkohol | Usnadňuje oddělení fází a zabraňuje pěnění |
| Chaotropní soli | Dehydratují silikátový povrch pro vazbu DNA |
| Etanol, izopropanol | Vysrážení DNA z roztoku |
| EDTA (etylendiaminotetraoctová kyselina) | Chelatuje kovové ionty, chrání DNA před degradací |
| Glykogen | Inertní neutrální nosič, neinhibuje DNA-protein interakce a enzymové reakce, neinterferuje s určováním koncentrace RNA/DNA (purifikovaný glykogen zbavený DNA, RNA a proteinů). Může inhibovat některé DNA-protein interakce. |
Další metody extrakce DNA jsou založené například na jiných principech vazby DNA, ale výše popsané jsou nejběžnější a nejrozšířenější v laboratorní praxi.
Čtěte také: Kročejová izolace a její použití
Čtěte také: Informace o úpravě povrchu dřevovláknité izolace
tags: #proteinkinaza #a #dna #izolace
